단백질 추출과 전기 영동

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  댄백질 추출과 전기영동

* Reference : 이화여대 분자생명과학부 생명과학실습2 Report *

 1) 겔 전기영동
 (1) 아가로오스 겔 전기영동
 아가로오스 겔은 해상도는 낮지만, DNA 단편을 200 bp에서부터 50 kb까지 분리할 수 있으며 사용이 간편하고, 다루기가 쉽기 때문에 현재 가장 많이 사용되고 있는 전기영동이다. 아가로오스는 해초로부터 추출되는 물질로서 선형 중합체의 형태를 하고 있다. 아가로오스 겔은 적당한 완충용액(buffer)에 녹여서 원하는 크기의 틀에 부어지며, 겔이 굳은 후에 사용된다. 겔이 굳는 동안 아가로오스는 지지체(matrix) 형태가 되며, 그 밀도는 아가로오스의 농도(%)에 따라 정해진다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면, 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이동한다. 이때 DNA가 이동하는 정도는 여러가지 요인의 영향을 받는다.  


핵산을 분리하기 위한 전기영동 (주로 아가로오스 젤에서 사용)


아가로오스의 화학적 구조(a) 와 젤을 형성할 때 만들어지는 중합체의 구조(b)


 아가로오스 겔에서 DNA의 이동에 영향을 주는 요인에는 DNA 크기, 아가로오스 농도, DNA 형태, 전압, 완충용액의 조성 등이다.
 일반적으로 DNA 크기와 전기장에서의 이동성(mobility)의 관계는 로그함수로 반비례 한다.  큰 분자는 작은 분자 보다 더 천천히 움직인다. 왜냐하면 큰 분자는 작은 분자 보다 겔의 구멍(pore)을 지나기가 어렵기 때문이다. DNA 단편은 아가로오스의 농도에 따라 각각 다른 속도로 움직인다.  이것이 아가로오스 겔이 넓은 범위의 DNA를 분리할 수 있게 해주는 중요한 요인이다. 


아가로오스의 농도에 따른 DNA 단편의 분리 범위

아가로오스 농도 (% W/V)	DNA의 분리범위 (kb)
0.3	5 - 60
0.6	1 - 20
0.7	0.8 - 10
0.9	0.5 - 7
1.2	0.4 - 6
1.5	0.2 - 3
2.0	0.1 - 2

같은 분자량의 DNA라도 초나선 환상형(supercoiling circular) DNA (I 형), 열린 환상형(nicked circular) DNA (II 형) 그리고 선형(linear) DNA (III 형) 등 DNA 형태에 따라 아가로오스 겔 상에서 다른 속도를 보인다. 0.1 - 0.5 mg/ml의 EtBr(ethidium bromide) 존재하의 아가로오스 겔에서 I 형은 II 형이나 III 형 보다 빨리 움직인다. 그리고 2 kb 이상의 DNA 단편을 효과적으로 분석하기 위해서는 5 V/cm 보다 낮은 전압을 이용해야 한다.
 전기장에서의 이동성은 전기영동 완충용액의 이온 강도와 조성에 영향을 받는다. 이온 강도가 너무 낮으면 DNA 이동이 너무 느리고, 이온 강도가 너무 높으면 열이 발생하여 심한 경우 겔이 녹거나 DNA의 원래 구조가 변하게 된다. 실험실에서 많이 사용하는 완충용액은 TAE 와 TBE 완충용액이다. 그 조성은 다음 표와 같으며, 일반적으로 전기영동 완충용액은 농축하여 만들어 상온에서 보관하여 사용한다. 


표 12-2. 전기영동 완충용액의 조성그리고 포름알데히드(formaldehyde) 아가로오스 겔 전기영동은 변성겔 전기영동이다. RNA는 단일가닥이면서 이차구조를 갖는 경우가 많으므로 주로 변성겔을 이용하여 전기영동을 해야 한다. 아가로오스 겔을 만들 때 변성제(denaturing agent)인 포름알데히드를 넣어 RNA용 변성겔을 만들 수 있다. 포름알데히드는 독성이 있으므로 화학물질 환기구가 있는 곳에서 겔을 만들고 전기영동을 하여야 한다. 그리고 가능하다면 항상 뚜껑을 닫아놓도록 한다.



(2) 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동
 아크릴아마이드는 단량체(monomer)인데 ammonium persulfate(APS)와 TEMED (N,N,N',N'- tetramethylethylenediamine)같은 자유 전자를 가진 화학물질이 존재하면 연쇄 반응(chain reaction)을 일으켜서 긴 사슬로 중합체화 된다. 이때, 이중기능 작용제(bifunctional agent)로 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드(N,N'-methylenebisacryamide)가 이 중합화 반응에 첨가되면 긴 사슬에 상호 결합이 일어나 겔 형태로 굳어지게 된다.  이 사슬의 길이는 중합화 반응에서의 아크릴아마이드 농도에 좌우되며, 매 29 단량체의 아크릴아마이드마다 1 분자의 상호결합 연결자(cross linker)가 붙게 된다. 각기 다른 폴리아크릴아마이드 농도를 가진 겔의 DNA 분리 범위는 표 12-3과 같다.

표 12-3. 폴리아크릴아마이드 농도에 따라 효과적으로 분리할 수 있는 DNA 단편의 범위

완충용액	사용 용액	농축 보관액 조성 (리터당)
Tris-acetate (TAE)	1× : 0.04 M  Tris-acetate0.001M EDTA	50× : 242 g Tris-base                   57.1 ml Glacial acetic acid                  100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
Tris-borate (TBE)	0.5× : 0.045 M Tris -borate0.001 M EDTA	5× : 54 g Tris base                             27.5 g Boric acid                     20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)

아크릴아마이드(% W/V)	분리범위 (bp)	Xylene cyanol FF	Bromophenol blue
3.5	1,000 - 2,000	460	100
5.0	80 - 500	260	65
8.0	60 - 400	160	45
12.0	40 - 200	70	20
15.0	25 - 150	60	15
20.0	6 - 100	45	12

폴리아크릴아마이드의 준비는 아가로오스 겔보다 까다로운 편이다. 폴리아크릴아마이드 겔은 대부분 스페이서(spacer)로 간격을 만든 2 장의 유리판 사이에 겔을 부어서 만드는데 이것은 아크릴아마이드 용액을 공기에 노출시키지 않기 위해서이다. 왜냐하면 산소에 의해서 중합화 반응이 방해될 수 있기 때문이다. 이러한 점에도 불구하고 아가로오스 겔과 비교하여 3 가지 장점이 있다.
 첫째, 해상도가 훨씬 좋다. 아크릴아마이드 농도에 따라서 1 개의 염기쌍 차이도 구분할 수 있다. 둘째, 훨씬 많은 양의 시료를 다룰 수 있다(loading을 많이 해도 해상도에 영향이 적음). 셋째, 겔로부터의 DNA 회수가 쉽고 깨끗한 DNA 를 얻을 수 있다.
 이러한 폴리아크릴아마이드 겔에는 비변성용 폴리아크릴아마이드겔과 변성용 폴리아크릴아마이드겔이 있다. 비변성용 폴리아크릴아마이드 겔은 이중가닥 DNA의 분리와 순수정제를 위한 겔로서 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드의 비율은 29 : 1, 1X TBE 를 사용하며 낮은 전압(1-8 V/cm)에서 겔을 런닝시킨다. 변성용 폴리아크릴아마이드 겔은 단일가닥 DNA 조각의 분리와 순수정제를 위한 겔로서 이 겔은 우레아 또는 포름아마이드 존재하에서 겔을 중합화시킨다. 염기서열용(sequencing) 겔이 대표적인 경우이며, 방사성 표지 DNA 검출자(probe)를 분리할 때, 뉴클리아제 S1 지도 그리기(nuclease S1 mapping) 등에도 사용된다. 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드의 비율은 19 : 1을 사용한다.



수직용 아크릴아마이드 겔을 만들기 위해 필요한 장치.

염기서열용 겔 전기영동은 기본적으로 폴리아크릴아마이드 전기영동과 유사하다. 염기서열용 겔의 특징은 아크릴아마이드 : 비스아크릴아마이드의 비율이 19 : 1이며, 7-8 M의 우레아를 변성제로 넣어 준다는 것이다. 즉 염기서열용 겔은 우레아를 이용한 변성용 폴리아크릴아마이드 겔이다.
 염기서열용 겔에 쓰이는 아크릴아마이드의 농도는 분석하고자 하는 DNA 단편의 크기 따라 달라진다. 프라이머(primer)로부터 50 개 핵산(nucleotides) 정도의 염기서열을 읽고 싶다면 12-20% 농도의 아크릴아마이드 겔을 써야 하며, 프라이머로부터 25-400 개 핵산 정도를 읽고 싶다면 6% 아크릴아마이드를 포함하는 겔을 사용하면 된다. 프라이머로부터 보다 멀리 까지 읽고 싶다면 4% 나 5% 아크릴아마이드를 포함하는 겔을 만들어 사용하면 된다. 
 염기서열용 겔의 또 하나의 특징은 사용하는 콤이 특이하다는 점이다.  염기서열용에는 상어이빨 모양의 샥스투스(shark󰡑s tooth) 콤이 주로 사용된다.



샥스투스 콤의 사용법
(상어 이빨과 비슷한 모양으로 생겨서 샥스투스 콤이라고 불리운다. 겔을 만들 때는 편편한 쪽이 겔 쪽으로 향하도록 한다. 겔이 완전히 굳은 뒤에 콤을 빼내어 반대쪽의 상어 이빨같이 생긴 쪽을 겔에 살짝 꽂는다. 겔과 이빨사이의 공간에 시료를 loading한다.)



(3) SDS-PAGE (SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)
 아크릴아마이드 겔에서 단백질의 이동성은 전체전하나 크기 양쪽의 영향을 모두 받는다. 그렇기 때문에 다른 분자량을 갖는 다른 두 단백질이 상대적으로 비슷한 만큼의 전하를 갖는다면 겔 상에서 같은 속도로 움직일 수도 있다. 이러한 이유로 단순히 아크릴아마이드 겔에 단백질 시료를 주입하는 경우에 별다른 정보를 얻지 못하는 결과를 가져올 수도 있다. 또한 보통의 아크릴아마이드 겔에서는 여러 개의 단위체(subunit)로 이루어져 있는 단백질이 각 단위체로 분리되지 않고 하나의 띠로 나타나기 때문에 정확히 몇 개의 단위체로 이루어져 있는지, 각 단위체의 크기는 얼마나 되는지를 잘 알 수 없다.
 하지만 음이온성 세척제(anionic detergent)인 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 포함하는 아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 상에서 단백질은 각각의 단위체로 분리되어지며 각 단백질의 이동성은 로그함수적 크기로 분자량과 반비례하는 함수관계를 이룬다. 이러한 점 때문에 단백질의 분자량이나 단백질의 단위체를 분석할 때 SDS-PAGE를 널리 사용하게 되었다.
 이 방법을 사용하기 위해서는 단백질의 이황화 결합(S-S 결합 ; disulfide bond)을 끊어주기 위하여 시료를 loading하기 전에 SDS와 β-mercaptoethanol 또는 DTT 존재하에서 가열하여 시료를 준비한다. 그리고 SDS-PAGE를 위한 loading 완충용액은 SDS와 β-mercaptoethanol 또는 DTT가 들어있는 SDS-겔 loading 완충용액을 이용한다. 또한 분자량을 알고 있는 단백질을 표시자로 loading하면 시료 단백질의 분자량을 추정해 낼 수 있다.
 SDS-PAGE의 또 다른 특징은 불연속 완충용액 시스템(discontinuous buffer system)을 이용한다는 것이다. SDS 겔을 만들 때 각각 다른 pH와 이온 강도의 완충용액을 이용하여 퇴적(stacking)용 겔과 분리(resolving)용 겔을 만들며 런닝 완충용액 또한 다른 pH와 조성을 갖는다.
 즉, 시료와 퇴적용 겔은 Tris-Cl (pH 6.8)을 가지며 위쪽과 아래쪽 런닝 완충용액은 Tris-glycine (pH 8.3), 그리고 분리용 겔은 Tris-Cl (pH 8.8)을 갖는다. 이 시스템의 각 성분들은 모두 0.1% SDS를 포함하고 있다. 이 불연속 완충용액 시스템은 퇴적용 겔에서 시료 안의 모든 복합체들을 매우 적은 부피로 농축시켜서 분해용 겔에서 단백질의 해상도를 크게 증가시켜주는 역할을 한다.

불연속 완충용액 시스템을 이용한 SDS-PAGE의 원리

시료가 웰(well)에 넣어진 후 전기영동을 시작한다.  단백질이 퇴적용 겔 안에서 농축된다.  단백질들이 분리용 겔에서 분리된다. 



수직용 전기영동 장치 
(A) 냉각 장치를 포함한 단백질 분리를 위한 전기영동 장치 (B) 겔을 만들기 위한 장치 

대부분의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 아크릴아마이드 : 비스아크릴아마이드의 비율은   29 : 1이며 각각 다른 아크릴아마이드 농도에서 효과적으로 분리되는 단백질 분자량의 범위는 표 12-4와 같다.

   표 12-4. SDS-PAGE에서 효과적으로 분리할 수 있는 단백질의 범위

아크릴아마이드 농도 (%)	단백질의 분리범위 (kD)
15	12 - 43
10	16 - 68
7.5	36 - 94
5.0	57 - 212

단백질 전기영동의 기본원리는 DNA나 RNA 전기영동의 원리와 같다. 다만, 단백질을 변성시키기 위해 우레아나 포름아마이드 대신 SDS를 이용한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 주로 이용한다는 것과 단백질을 눈으로 확인하기 위하여 EtBr 대신 쿠마시 블루(coomassie blue)나 실버(silver) 염색 방법을 쓰거나 항체를 이용한다는 것 등이 다른 점이다. 쿠마시 블루 염색에 의한 겔 상의 단백질 띠 검출은 염색제(dye)와 단백질 간의 비특이적 결합에 의한 것이며 0.3-1 mg의 단백질까지 인식할 수 있다. 실버 염색은 실버와 단백질 안의 화학잔기 간의 결합에 의한 것으로 2-5 ng 정도의 단백질까지 인식할 수 있다.



연속 완충용액과 불연속 완충용액 시스템을 이용한

원통(rod)형 겔과 판(slab)형 겔
(a) 연속 완충용액 시스템을 이용한 원통형 겔 (b) 연속 완충용액 시스템을 이용한 판형 겔 
(c)와 (d) 불연속 완충용액 시스템을 이용한 원통형 겔과 판형 겔